信帆生物告訴大家：如何收集用于western blot的細(xì)胞

提問：我現(xiàn)在在養(yǎng)細(xì)胞，然后收細(xì)胞抽蛋白以及提RNA用，我想先多收點(diǎn)細(xì)胞凍著。想問一下怎樣收集細(xì)胞，有具體的流程嗎?

我是這樣做的：

1、將細(xì)胞消化吹打后轉(zhuǎn)移至離心管離心

2、倒去上清，加1 mlPBS打勻后轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管

3、離心12000 rpm 2 min (不知道大家這里用多少轉(zhuǎn)速，有講究嗎?)

4、倒去上清，我是將EP管倒置一會(huì)，但是EP管里面還是有一些上清，我沒有倒干凈，請(qǐng)問是不是要倒干凈上清啊?因?yàn)槲視簳r(shí)還不抽提，離心后EP管是放到-80度冰箱保存的。這個(gè)上清對(duì)抽蛋白和RNA有影響嗎?

問題答復(fù)：

收集流程沒有什么特殊的，和你寫的一樣，主要注意以下事項(xiàng)：

1、1 ml的PBS可能溶不了那么多細(xì)胞(如果你細(xì)胞多的話)，所以建議用3 mlPBS，分兩管裝，離完心后用Trizol溶解合成一管

2、離心的速度太大了，細(xì)胞會(huì)死的，建議800 轉(zhuǎn)，5 分鐘，一般的細(xì)胞都可以離下來

3、需要去上清，如果是提RNA就用Trizol溶解合成一管，然后放在-80度冰箱，如果提蛋白就直接將離心后的細(xì)胞放在-80度冰箱。上清對(duì)于提蛋白和RNA沒什么影響。還有一點(diǎn)，提RNA的東西一定要高壓，如果是初次做可以用DEPC水泡槍頭，可以提高作成功的幾率。如果操作嚴(yán)格，可以只把要用的槍頭和EP管高壓即可。