SABC（兔IgG）-FITC/POD雙標免疫組化試劑盒*！

產品名稱：         SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標 kit
產品規(guī)格：         100-200T
產品貨號：         SA0025
產品單位：         盒
供貨商：    上海信帆生物

SABC（Strept Avidin-Biotin Complex）法是一種顯示組織和細胞中抗原分布的簡便而敏感的免疫組化染色方法。在實際實驗過程中，其比直接酶標二抗敏感5-10倍，是免疫組化的理想方法。     

基本原理     

SABC是鏈霉親和素-生物素-酶（或者FITC）復合物。     
親和素（Avidin）存在于雞蛋中，分子量67000，是一種堿性蛋白。對生物素有很強的結合力。鏈霉親和素是從鏈霉菌中提取的一種蛋白質，分子量47000，等電點為6.0-6.5，也對生物素有很強的結合力，但其等電點接近中性，明顯消除了原堿性蛋白所引起的非特異性吸附。     

生物素活化后，可以標記抗體和酶而不影響其活性。再經SABC放大，一分子的抗體可以結合幾十分子的酶或者熒光素，從而有很強的放大作用。     

SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測而設計的，用以顯示組織和細胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質，同親和素一樣，對生物素有*的親和力，親和素是一個堿性蛋白質（IP=10），經改造后可以轉變成中性蛋白質。鏈霉親和素等電點接近中性，對組織和細胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個左右的過氧化物酶和五十個左右的鏈霉親和素所構成的復合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。     
 

自備試劑：     
      
1．粘片劑多聚賴氨酸。     
      
2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）     
      
3． 0.01M檸檬酸鈉緩沖液     
      
4、抗熒光衰減封片劑    

SABC（兔IgG）-FITC/POD雙標免疫組化試劑盒*！

 
實驗步驟:     
      
以石蠟切片熱修復為例     
      
1. 切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內源性酶（如果FITC，剛可省掉此步）。蒸餾水洗3次。     
      
2．熱修復抗原:將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。     
      
3．滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。     
      
4．用稀釋液將一抗（如兔抗IL-10）按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗，37 ℃ 1小時左右或20℃時2小時左右。也可4℃過夜。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關系。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間。）     
      
5．根據(jù)使用量,用稀釋液將生物素化二抗?jié)饪s液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul生物素化羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。     
SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標 kit     
如果想用熒光觀察，請接下面步驟，如果想用DAB顯色，請?zhí)^6-7。     
      
6．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-FITC濃縮液，混勻即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃，30分鐘(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。     
      
7．滴加抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。     
      
如果想用DAB顯色，請接8。     
      
8．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。     
      
9．DAB顯色:根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B 。混勻后加至切片。室溫顯色, 鏡下控制反應時間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應。     
      
10．蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。     
對于細胞片，常規(guī)固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5%Txiton X-100室溫20分鐘，PBS漂洗兩次，3%H2O2（如果FITC，剛可省掉此步）處理15分鐘；PBS漂洗兩次，下接上面第4步。     
對于冰凍切片，固定后，可用PBS漂洗兩次，再接上面第二步。

SABC（兔IgG）-FITC/POD雙標免疫組化試劑盒*！