南京信帆生物技術(shù)有限公司專注于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，集化學(xué)試劑、生物試劑、銷售于一體的生物公司為各大高校，科研單位、醫(yī)院、制藥與診斷試劑生物試劑廠家等客戶提供多種生物學(xué)檢測ELISA試劑盒，品質(zhì)，性能穩(wěn)定，可與ELISA試劑盒開發(fā)行業(yè)內(nèi) 品質(zhì)相媲美。
我司的ELISA試劑盒的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生物試劑。目前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用zui廣。
1.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量zui高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應(yīng)的zui適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，zui高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應(yīng)時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)中zui常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色，zui大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，zui大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯
酶標(biāo)抗體標(biāo)記效果測定：測定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。
(2) 結(jié)合物的定量測定 一般是對結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進(jìn)行測定，然后按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對于過碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可計算出標(biāo)記抗體的摩爾（mol）比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結(jié)合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結(jié)合物溶液量
結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時加入的酶量×100%
用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達(dá) 1000(g/ml時效果。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不*可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時。酶結(jié)合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達(dá)30%以上時。
更新時間：2014-01-02 
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