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免疫熒光實(shí)驗(yàn)

抗體球蛋白標(biāo)記上熒光色素，即成為熒光抗體。這是利用某些熒光色素在一定條件下可與抗體分子結(jié)合，但不影響抗體的免疫活性。用熒光抗體浸染可能含抗原的細(xì)胞或組織切片，如有相應(yīng)抗原存在，則抗原與標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物固定于細(xì)胞上，不容易洗脫，在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見(jiàn)物體，可達(dá)到診斷及定位的目的。

免疫熒光是一種將抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法。該法把血清學(xué)的特異性、熒光色素的敏感性、顯微鏡檢查法集為一體，擴(kuò)大了免疫學(xué)診斷的效果，是近代免疫學(xué)的一種重要研究手段?？贵w球蛋白標(biāo)記上熒光色素，即成為熒光抗體。這是利用某些熒光色素在一定條件下可與抗體分子結(jié)合，但不影響抗體的免疫活性。用熒光抗體浸染可能含抗原的細(xì)胞或組織切片，如有相應(yīng)抗原存在，則抗原與標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物固定于細(xì)胞上，不容易洗脫，在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見(jiàn)物體，可達(dá)到診斷及定位的目的。

• 實(shí)驗(yàn)原理

將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程

免疫熒光單標(biāo)記方法

免疫熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡(jiǎn)單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問(wèn)題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

1、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞。

b, 一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min)。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液。

2、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問(wèn)固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問(wèn)20-30 min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過(guò)夜?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸干。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

免疫熒光雙標(biāo)記方法

免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些，首先應(yīng)注意所用的一抗必須是來(lái)自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來(lái)自家兔；B抗體為單克隆抗體，來(lái)自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊，且盡量遠(yuǎn)離，通?？梢赃x擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來(lái)組合。通常情況下，染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí)，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。

四、客戶提供

細(xì)胞株或細(xì)胞爬片。（注：細(xì)胞爬片不宜太密；細(xì)胞必須固定。）組織切片，一抗

五、公司提供

實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)試劑、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝